Virologiset tutkimusmenetelmät

Ruokavaliot

Virologiset tutkimusmenetelmät ovat laajalti käytössä lääketieteessä erilaisten tarttuvien ja tiettyjen viruslääketieteellisten sairauksien diagnosoimiseksi.

Virologiset tutkimusmenetelmiä käytetään myös tunnistamaan viruksen, tutkimalla niiden biologian ja kyky vaikuttaa eläimen ja ihmisen soluja, mikä edelleen auttaa ymmärtämään synnyssä virustautien ja valita oikea menetelmiä niiden hoitoon. Taudin etiologian ja hoidon tehokkuuden seurannan lisäksi virologiset tutkimusmenetelmät ovat erittäin tärkeitä antiepidemisten toimenpiteiden määrittelyssä ja toteuttamisessa.

Virologian suorat tutkimusmenetelmät

Suorat virologiset tutkimusmenetelmät voivat havaita viruksen, viruksen nukleiinihapon tai viruksen antigeenin suoraan kliinisessä materiaalissa ja ovat näin ollen nopeimmat (ekspressiomenetelmät - jopa 24 tuntia). Nämä menetelmät ovat vähemmän informatiivisia ja edellyttävät laboratoriotutkimusta epäsuorilla diagnoosimenetelmillä väärien negatiivisten tai väärien positiivisten tulosten usein saamisen yhteydessä. Seuraavat tutkimusmenetelmät ovat suoria:

  • värjäystä elektronimikroskoopilla virusten negatiivisten sijaan (läsnäolon määrittämiseksi viruksen ja sen pitoisuus materiaalin, edellyttäen, että 1 ml sisältää vähintään 105 viruspartikkelia);
  • Immuunisähkömikroskopia, joka perustuu spesifisten vasta-aineiden vuorovaikutukseen virusten kanssa muodostamaan komplekseja, jotka on helpompi havaita negatiivisella kontrastilla kuin virukset yksinään;
  • entsyymi-kytketty immunosorbenttimääritys (ELISA) käyttäen entsyymileimattuja vasta-aineita, jotka sitoutuvat antigeeneihin, muodostaen komplekseja, jotka tunnistetaan lisäämällä substraattia käytetylle entsyymille;
  • immunofluoresenssireaktio (RIF) - suoraan tai epäsuorasti - perustuu fluoresoivan väriaineen vasta-aineiden käyttöön;
  • radioimmunomääritys (RIA) perustuu radioleimatun vasta-aineen ja gamma-laskureiden käyttöön;
  • sytologiset menetelmät perustuvat värjäytyneiden märkien, biopsianäytteiden, ruumiinavausmateriaalien mikroskooppiseen tutkimiseen;
  • molekyylimenetelmät - molekyylihybridisaatiolla nukleiinihappojen ja polymeraasiketjureaktio (ensimmäinen perustuu havaitsemiseen komplementaarisen juosteen nukleiinihappojen merkin kanssa, ja toinen - on virus-erityisten DNA-sekvenssien replikaation periaatteessa kolme vaihetta).

Nukleiinihappojen molekyylihybridisaatiossa on kolme varianttia: pistehybridisaatio, blottahybridisaatio (käytetään HIV-infektion diagnosointiin) ja in situ -hybridisaatio (suoraan infektoiduissa soluissa). PCR: tä (polymeraasiketjureaktiota) käytetään nykyään yhä enemmän virusinfektioiden seurantaan ja diagnosointiin tämän menetelmän korkean herkkyyden ja spesifisyyden takia.

Epäsuorat virologiset tutkimusmenetelmät

Nämä menetelmät perustuvat viruksen tunnistamiseen ja tunnistamiseen. Nämä ovat aikaa vieviä ja pitkiä tekniikoita, mutta tarkempia. Materiaalia tällaisissa tutkimuksissa voi olla sisällön rakkulat, kaavituista (varicella, herpesleesioiden ihon ja limakalvojen), nenänielun pesu (hengitystieinfektiot), veren ja aivo-selkäydinnesteen (varten arbovirus infektiot), ulosteeseen (sillä enterovirusinfektio) pesunesteet (jossa tuhkarokko, vihurirokko jne.). Johtuen siitä, että virukset voivat replikoitua vain elävissä soluissa, viljelemällä virus suoritetaan kudosviljelmässä kananmunan tai eläimen ruhon (hamsterit, valkoiset hiiret, koirat, kissat, jotkut lajit apinoita). Osoitus virus kuljetetaan sytopaattisen vaikutuksen, vastauksena gemadsorbtsii väri näytteen tulokset hemagglutinaation inhibition, on muutoksia tai niiden puuttuminen kanan alkioiden tai kudosviljelmät, selviytyminen herkkä eläimiä.

Virologiassa käytettävät serologiset diagnostiset menetelmät

Serologinen diagnoosi tarkoittaa virologisia tutkimusmenetelmiä, jotka perustuvat antigeeni-vasta-ainereaktioon. Useimmiten käytetään pariksi verta seerumeita, jotka otetaan useamman viikon välein. Kun vasta-ainetitteri kasvaa 4 kertaa tai enemmän, reaktiota pidetään positiivisena. Virusten tyypin määrittämiseksi käytetään viruksen neutralointireaktiota ryhmän spesifisyyden määrittämiseksi komplementin kiinnitysreaktioksi. Myös yleisesti käytetty passiivinen hemagglutinaatio reaktio, hemagglutinaation inhibition, käänteinen passiivinen hemagglutinaation, RIF ja erilaisia ​​suoritusmuotoja immunomääritys.

Viime aikoina geenitekniikan tutkimusten aikana on kehitetty tekniikka monoklonaalisten vasta-aineiden hankkimiseksi. Monokloonien kapea spesifisyys pääsee ratkaisemaan käyttämällä useita monoklonaalisia vasta-aineita erilaisiin viruksen määrittäjiin. Tämä lisäsi virologisten tutkimusmenetelmien herkkyyttä ja spesifisyyttä viruksen antigeenien määritelmän avulla. Tällä hetkellä on kehitetty monia erilaisia ​​testijärjestelmiä virusinfektioiden immunologiseen diagnosointiin.

Menetelmät virusten tutkimiseen.

Historiallisesti virologian irrotettiin mikrobiologian, ja jopa mikrobiologisia tekniikkaa ei ole voitu käyttää, kun työskennellään viruksia, kuten yleiset periaatteet aseptisia tekniikoita saada puhtaat linjat, titrausmenetelmät, ja lopuksi, rokotus, muodosti perustan uudelle tiedettä. Tutkimus tärkeimpien virusten ominaisuuksista edellytti useiden erityisten menetelmien kehittämistä. Täten virusten kykyyn läpi bakteerien suodattimia käytettiin määrittämään niiden koon ja puhdas, pieni koko virusten stimuloi luominen kehittyneempiä mikroskopia tekniikoita. Tekninen arsenaali of Virology vähitellen rikastettu menetelmiä fysiikan, kemian, genetiikan, sytologia, molekyylibiologian ja immunologian.

Viruksia mitattiin ja punnittiin, niiden kemiallinen koostumus, lisääntymismallit, luonteenpiirteet, rooli tautien alkuperän suhteen ja kehitettiin tehokkaita menetelmiä virusinfektioiden torjumiseksi. Viruksia kasvatetaan erityisin menetelmin, infektoimalla laboratoriot eläimiä, kanan alkioita ja kudosviljelmää. Virologian aamulla tutkimuksia tehtiin laboratorioeläimillä (valkoiset hiiret, marsut, kanit). He ottivat käyttöön "epäilyttävää materiaalia" ja arvioivat sairauskuvion perusteella, mistä viruksesta se aiheutti. Kertomiseen ja viruksen eristäminen, paitsi laboratorio- eläimet alkoivat käyttää kehittämään kanan alkiot, jotka ovat hyvin moninkertaistaa jotkut virukset, varaamiseen, joskus jopa huomattavia määriä.

Alusta lähtien 50-luvun XX vuosisadan, kehittäneet menetelmän kudosviljelmän soluissa elävää kudosta erotetaan entsyymejä, siirretään erityisen steriiliin säiliöön, lisätä monimutkainen koostumus ravintoalustaa ja laittaa inkubaattorissa kasvua. Solut alkavat jakautua ja vähitellen kattavat lasin pinnan tasaisella kerroksella. Jos tällaisia ​​soluja infektoidaan viruksella, niiden tuhoisaa vaikutusta voidaan suoraan havaita. Kudosviljelmän menetelmä mahdollistaa uusien virusten avaamisen ja tutkia virusten ja solujen vuorovaikutusta.

Virusten lajien eristäminen, lisääntyminen ja tunnistaminen ovat käytännön virologian tärkeimmät menetelmät. Tämä työ koostuu yleensä kahdesta pääosasta: viruksen tartunnan saaneiden solujen tutkimuksesta ja eristettyjen virusten tutkimuksesta.

Erilaisia ​​menetelmiä virologian diagnostiikkaa käytetään tartunnan saaneiden solujen: fluoresenssivasta-menetelmällä, voit selvästi havaita virusten soluissa, jotka näyttävät puhtaana; menetelmä viruksen lisääntymisen nopeuden ja luonteen rekisteröimiseksi, joka perustuu (täydellisten tai osittaisten) solujen tuhoamiseen. On tärkeä rooli diagnoosissa virusinfektion lähettää määrittämisessä vasta-ainetiitterit seerumissa potilailla avulla erilaisten immunologisten reaktioiden - neutralointi, komplementin kiinnittymisen hemagglutinaatio viive ja muut.

ΙΙ. Rakenteen ominaisuudet ja virusten lisääntyminen

Jo pitkään virusten olemassaoloa arvioitiin niiden patogeenisten vaikutusten perusteella. Suoraan katsoa, ​​että virukset olivat mahdollisia vasta elektronisen mikroskoopin keksimisen jälkeen, mikä lisäsi kymmeniä ja satoja tuhansia kertoja. Tämä tapahtui noin 50 vuoden kuluttua virusten löytämisestä.

Suurimmat virukset lähestyvät pienten bakteerien, pienimpien ja suurten proteiinimolekyylien kokoa esimerkiksi veren hemoglobiinin molekyylin suhteen. Toisin sanoen virusten joukossa on jättiläisiä ja kääpiöjä. Virusten mittaamiseen käytetään ehdollista arvoa, jota kutsutaan nanometriksi (nm). Yksi nanometri on miljoonasosa millimetristä. Eri virusten koot vaihtelevat välillä 20 - useita satoja nm. Vertailun vuoksi annamme pienimpien verisolujen erytrosyyttien arvon, joka on 7000-8000 nm, ts. virukset ovat pienempiä kuin punasolut kymmeniä ja satoja kertoja. Virusten kehon ulkoasu muistuttaa kuutiota, tikkuja, palloja, polyhedraa ja filamentteja.

Yksinkertaiset virukset koostuvat proteiineista ja nukleiinihaposta. Tärkein osa viruspartikkelia on nukleiinihappo - se on geneettisen informaation kantaja. Jos ihmisen solut, eläinten, kasvien ja bakteerien aina sisältää kaksi nukleiinihappojen - deoksiribonukleiinihappo - DNA: ta ja ribonukleiinihapon - RNA: ta eri virusten havaittiin, vain yksi tyyppi - joko DNA: ta tai RNA: ta, joka muodostaa perustan niiden luokittelua. Virion toinen pakollinen osa on se, että proteiinit eroavat toisistaan ​​eri viruksilla, mikä mahdollistaa niiden tunnistamisen immunologisilla reaktioilla.

Monimutkaisempia viruksia proteiinien ja nukleiinihappojen lisäksi sisältävät hiilihydraatteja, lipidejä. Jokaisella virusryhmällä on oma joukko proteiineja, rasvoja, hiilihydraatteja ja nukleiinihappoja. Jotkut virukset sisältävät entsyymejä.

Kukin komponentti virionin on tiettyjä toimintoja: proteiini kuori suojaa haitallisia vaikutuksia, nukleiinihappo on vastuussa perinnöllinen ja tarttuvan ominaisuuksia ja on johtavassa asemassa vaihtelevuuden viruksen, ja entsyymejä, jotka liittyvät niiden lisääntyminen. Tyypillisesti nukleiinihappo sijaitsee keskellä virionin ja ympäröi proteiini takki, kuin jos käyttää sitä. Kapsidin koostuu tietyllä tavalla samanlainen pinottu proteiinin molekyylien, jotka muodostavat symmetrisen muotoisia, yhdessä nukleiinihapon viruksia. Tapauksessa kuutio symmetria nukleokapsidin nukleiinihappojuosteelle kaulitaan pallon ja kapsomeeristä on tiiviisti pakattu sen ympärille. Järjestetty siten, polioviruksia, jalka ja sorkkatauti, adenovirus, reovirukset, rhinovirukset, ja muut. Kun kierre (sauvamaisia) symmetria-viruksen nukleokapsidi nukleiinihappojuosteelle kierretty spiraalimaisesti, kukin vuorollaan sen piiriin kapsomeerien tiiviisti vierekkäin. Kapsomeerien rakenne ja virion ulkonäkö voidaan havaita elektronimikroskopialla.

Kuvio 3. - Ihmisen immuunikatoviruksen (1-kapsomeerit, 2-genomi, 3-lipoproteiinikotelo (super-kapsidi), 4-glykoprotidi)

Monimutkaisesti järjestetyissä viruksissa ydin, joka on tiukasti taitetun heliksin muodossa, peitetään yhdellä tai useammalla ulkokuorella, jotka sisältävät erilaisia ​​aineita. Tällaisella rakenteella on esimerkiksi isorokko-, influenssa- ja parainfluenssaviruksia. Viruksen bakteerien - bakteriofagien (faagien) rakenne, joka koostuu päästä ja hännästä, on tutkittu yksityiskohtaisesti. Faagein häntä on pukeutunut proteiinipäällysteeseen, josta pitkät ohut kuidut lähtevät, ja heittäytyvät roiskeilla, kun faagipartikkeli kiinnittyy bakteeriin.

Lähetä päivämäärä: 2016-06-22; katsottu: 1281; TILAA TYÖSKENTELY

Menetelmät virusten tutkimiseksi

VIRUSOLOGISET TUTKIMUKSET - virusinfektioiden diagnosointiin, asiaankuuluvien taudinaiheuttajien tutkimiseen, niiden leviämiseen luontoon ja myös virusvalmisteiden tuotantoon. Virologisissa laboratorioissa (katso) hunaja. profiilia tutkitaan ihmisviruksina, joten joissakin tapauksissa myös eläinvirukset (esim. suorittavat raivotauti-diagnostiikkaa koirilla, eläinten tutkimukset, joita käytetään virusvalmisteiden tuottamiseen). Molempien tutkimusmenetelmät ovat samankaltaiset.

Yksi V ja. on virusten eristäminen. Kun ihmisten virukset eristetään verestä, käytetään erilaisia ​​salaisuuksia ja eritteitä, elinten kappaleita. Useimmiten verta tutkitaan arbovirusairauksissa. Käytetään kokonaan defibrinoidun tai hemolysoidun veren, joitain sen elementtejä tai hyytymiä (taudin myöhäisvaiheissa). Raivotauti, epidemia, parotitis, herpes simplex löytyvät sylki. Nasofaryngeal pesut palvelevat eristää influenssan, tuhkarokko, psittacosis, rhinoviruses, respiratory syncytial virus, adenovirukset patogeenejä. Sidekalvon kynsistä löytyy myös adenoviruksia. Pesu otetaan huuhtelemalla nenä ja nielu (erikseen) ja pesemällä sidekalvo isotonisella natriumkloridiliuoksella. Voit pyyhkiä nenänkanavat ja nielun takaseinä tamponeilla, jotka on kostutettu liemellä. Ei-steriiliä ainetta käsitellään antibiooteilla (1000 yksikköä penisilliiniä ja streptomysiiniä / ml) 30 minuutin ajan. Ulosteista erotetaan erilaiset enterovirukset, adeno- ja reovirukset. Näytteet laimennetaan 1:10 fosfaattipuskurilla, sentrifugoidaan kahdesti 20 minuutin ajan. 8000 rpm minuutissa. Antibiootteja lisätään kuten yllä on osoitettu. Vähemmän V ja. ottakaa pustulajärjestelmän sisältö (isorokkoa, kananpoikia, herpesia) ja pistele oireita (venerealinen lymphogranuloma). Osittainen materiaali on otettava mahdollisimman pian ruumiin kuoleman jälkeen. Säilytetään tutkimusajankohtaan t ° -20 ° ja alle. Suorittaa V. ja. kangas murskataan (jauhetaan) ja 10-20% lietettä valmistetaan isotonisella natriumkloridiliuoksella tai ravinnealustalla soluviljelmille. Sentrifugoidaan 20 minuuttia. 1500 rpm; Supernatanttia käytetään jatkotutkimukseen.

Virusten eristämiseksi laboratorioeläimiä, lintu-alkioita, solu- ja kudosviljelmät infektoidaan. Eläimet ovat sopivia, jos virus aiheuttaa heille selkeitä taudin kliinisiä oireita tai patogeenisia muutoksia (esim. Halvaus, keuhkokuume jne.). Viruksen tropismista riippuu materiaalin käyttöönoton yhden tai toisen tavan tehokkuus. Usein käytetty infektio ihon alle, intraperitoneaalisesti ja suonensisäisesti. Neurotrofinen viruksia havaitaan infektion eläimet aivopuoliskon (arboviruksiksi, rabies-virus, jne.), Thalamus (polio virukselle kokeissa apinoilla), selkäydin. Hyönteisten ja herprosin viruksia voidaan havaita soveltamalla materiaalia kaniineille scarified sarveiskalvoon. Jotkut virukset tunnistetaan helposti kun ne oli ympätty etukammioon (esim., Hepatiitti B -viruksen koirilla kokeellisesti pentuja). Tutkimukseen hengitystieinfektioita, normaalisti käytetyillä aineilla nenänsisäisesti tartunnan saaneiden eläinten (tiputuksen nenään materiaali nukutettiin eläimen tai annetaan sen aerosolin muodossa erityiseen kammioon). Ruoansulatuskanavassa materiaali ruiskutetaan ruoalla tai suu suuttuu tylpällä neulalla. Kun tutkitaan joitakin onkogeenisiä viruksia, käytetään kultaisen hamstereiden infektoitumista poskipussin limakalvoon.

Monille viruksille vastasyntyneet eläimet ja imevät ovat herkempiä seksuaalisesti kypsälle yksilölle. Sucking hiiriä käytetään laajalti Arbovirusten ja Coxsackie-virusten eristämiseen (tartunnan jälkeen aivoihin). Jotkut adenovirukset pystyvät indusoimaan kasvaimia, joilla on vastasyntyneiden kultaisten hamstereiden ihonalaista infektiota. Useiden lintuvirusten tutkimusta tehdään ensimmäisten elämänpäivien poikasten osalta.

Kana-alkioiden käyttö on useita etuja. Heidän eriytymättömillä kudoksillaan on monenlaista herkkyyttä monille viruksille. Tartunnan esiintyminen arvioidaan kuoleman alkion, ulkonäön muutoksia (pistesyöpymistä) on korioallantoinen kalvo (Fig. 1), kertyminen nesteiden alkion hemagglutiniini ja komplementin sitova virusantigeeni. Alkioiden siirrostettiin rakkokalvon (ikäinen 11-12päivä poxvirus ryhmä) rakkokalvon ja lapsivesi onteloita (10-11 päivän miksovirusami), ruskuaispussin (iältään 5-6 päivää patogeeneihin psittakozaornitoza et ai.). Aineksen inokulointi alkiolle aivoissa ja suonensisäisesti (kalvojen aluksiin) on harvoin tehty. Kaikilla tartuntatavoilla alkioita voidaan traumatisoida, joten ne, jotka tapetaan ensimmäisten 24-48 tunnin aikana. pois kirjanpidosta.

Tutkimaan vaikutusta kemian viruksiin. aineet ovat erittäin käteviä embryonisoituja munia, joissa alkio on poistettu, mutta kromanteenttinen kalvo säilyy. Sisällä laittaa virus ja aine 20 ml: aan isotonista natriumkloridiliuosta. Aukko kuoressa suljetaan korkilla, jossa on putki, jonka kautta voit ottaa näytteitä analyysiin.

Lintujen eläimille ja alkioille tehtävien kokeiden arvioinnissa on pidettävä mielessä mahdollisuutta aiheuttaa piilevä infektio tai piilevän viruksen eristäminen.

Laajasti virusten eristämiseen ja kertymiseen käytetään solu- ja kudosviljelmien (katso). Näitä menetelmiä voidaan käyttää tunnetuimpien virusten viljelyyn (katso Viruksen viljely). Jotkut heistä kerääntyvät voimakkaasti jo viljelmien primaarisen infektion aikana, toiset edellyttävät useita jaksoja. Useimpien virusten lisääntyminen soluviljelmissä liittyy sytopaattisen vaikutuksen kehittymiseen. Luonteeltaan jossain määrin voidaan päätellä käytössä virukset kuuluvat tiettyyn kilpailu: picornaviruses aiheuttaa pyöristys ja solujen kutistuminen, adenovirus - klustereiden muodostamiselle pyöristetty solujen muodossa viinirypäleitä, miksovirusy ja herpesvirukset - muodostumista monen ytimen synsytian. Useita viruksia ei voida viljellä kehon ulkopuolella.

Joidenkin virusten (isorokko, mykso ja arbovirukset) lisääntyminen voidaan havaita hemodysorptio-reaktiolla, koska vaikutukset kärsivät solut kykenevät adsorboimaan punasoluja. Vastaavat erytrosyytit (ihminen, apina, marsu, kana) 0,4 - 0,5%: n konsentraatiossa pannaan yksikerrokseen t ° 4 °: ssa tai huoneenlämpötilassa 20-30 minuuttia. Erytrosyytit adsorboidaan diffuusiolla koko viljelmässä (esim. Parainfluenssavirukset) tai muodostavat saarekkeet (influenssavirukset, sikotauti).

Viruksen lisääntymistä arvioidaan joskus tutkimalla eläimen viljelynestettä eläimillä (tick-borne encephalitis) tai DSC: ssä. Viruksen läsnäolo, jolla ei ole sytopaattista aktiivisuutta, määräytyy joskus sen kyvyn häiritä sytopatogeenista virusta. Niinpä linnun leukemian viruksilla tartunnan saaneiden kanan alkioiden soluviljelmissä Raus -sarkooma-viruksen lisääntyminen on tukahdutettu. Havaita virukset netsitopatogennyh kantoja ripulin karjan ja hog koleran ehdotettu menetelmä END (korotukseen Newcastlen taudin virus) - superinfektio kulttuureissa Newcastlen tautia aiheuttava virus. Molempien virusten yhdistetyllä toiminnalla solujen tuhoaminen tapahtuu.

Kun sytopaattiset muutokset tai muut viruksen lisääntymisen merkit tulevat näkyviin, viljelynestettä käytetään viruksen tai kulkeutumisen tunnistamiseksi. Useat virukset ovat sidoksissa soluihin myös kulttuurin degeneraation (adenovirukset, isorokko-virukset) tapauksessa, jäädyttämällä ja sulattamalla viljelmät ennen nesteen keräämistä. Joitakin herpetisiä viruksia, esimerkiksi Marekin taudin virusta kanoissa, on siirrettävä yhdessä ehjien solujen kanssa.

Ihmisen hengityselimistön virusten ja joidenkin muiden ihmisten tutkimiseksi käytetään kudosviljelmän menetelmää eli viljeltyjen in vitro-kudosfragmenttien infektiota. Yleisimmin käytetty kudos on kanin henkitorvi. Moninkertainen virus vaikuttaa limakalvon endoteelisoluihin, mikä määräytyy siiman liikkeen lopettamisen myötä.

On otettava huomioon mahdollisuudet vierasaineisiin kudosten ja solujen viljelmissä. Ne voidaan viedä soluihin, jos jälkimmäiset otetaan tartunnan saaneesta organismista trypsiinistä tai seerumista, jota käytetään solujen viljelyyn.

Lisäksi kylvö- tai poikkipinta biopsiamateriaalissa jo kasvanut kulttuuri sovellettu suoraan viljelemällä soluja tutkittiin elimen trypsinisaation jälkeen, usein tehokkaampia vastaan ​​viruksen eristämisen (esim., Havaitseminen adenoviruksen nielurisojen). Käytetään myös sekoitetaan viljelmiä menettelyä, kun testi kehon solut kasvavat yhdessä minkä tahansa viruksen herkkiä tietyn solujen (esim., Ymppäämällä solut potilaiden aivoissa subakuutti sklerosoiva panenkefaliitti kanssa apinan munuaissolut tai HeLa-solujen eristäminen tuhkarokkoviruksen). Menetelmä sekaviljelmien on usein ainoa tapa eristää viruksen niistä tuumoreita eläimiä, jotka eivät tuota aktiivinen virus kuitenkin sisältää virusgenomin.

Yksikerroksiset soluviljelmät mahdollistavat viruksen - plakkien pesäkkeiden saamisen (kuvio 2). Yleensä plakit muodostavat viruksia, joilla on sytopaattinen aktiivisuus. Samalla tämä menetelmä voi havaita joitakin netsitopatogennye virukset (esim. Useita kantoja ripulin naudoilla). Plakkien saamiseksi virusta levitetään solun yksikerrokseen kuppeihin tai tasapulloihin. Infektion moninaisuus, so. Viruspartikkeleiden lukumäärä solua kohti, tulisi olla pieni, joten muodostuneet plakit eivät sulautuisi yhteen. 30-60 minuutin kuluttua. kerroksittain adsorptio väliaineessa 1,35-1,5% agaria, ja neutraali punainen lopullisessa laimennuksessa 1: 000 Culture 40 Petri inkuboidaan atmosfäärissä, jossa on 5-10% hiilidioksidia, ja hermeettisesti suljetuissa ampulleissa - tavanomaisessa uunissa. Muutaman päivän kuluttua elottomaksi värjätyt solut alkavat näkyä rappeutuneiden solujen maalaamattomia fokaaleja.

Voit asentaa agariin neutraalia punaista solua ja muutaman päivän kuluttua käyttää väriainetta toisen agarikerroksen; plakit näkyvät muutaman tunnin kuluttua. Agariin sisältyy joskus polysakkaridisulfaatteja, jotka ovat viruksen kasvun estäjiä; Niiden neutraloimiseksi protamiinisulfaattia (60 mg / 100 ml) lisätään väliaineeseen. Useiden virusten plakkien saamiseksi voidaan käyttää pinnoitteina metyyliselluloosaa ja muita aineita. Jotkut virukset (isorokko, tuhkarokko) muodostavat plakkeja ja ilman agar pinnoitetta. Plakkimenetelmä mahdollistaa viruskantojen kloonaalisen analyysin. Geneettisesti homogeenisten kloonien eristämiseksi uutetaan yksi plakki, jota käytetään seuraavaan infektioon. Yleensä kloonaus suoritetaan kolmelle kanavalle.

Plakkien menetelmä soveltuu myös määrittämään infektoidussa viljelmässä viruksen tuottavien solujen määrä (ts. Infektiokeskusten määrä). Tätä varten solut suspendoidaan, sijoitetaan yksikerroksiseen viruskriittisten indikaattorisolujen viljelmään ja täytetään agarilla. Tartunnan saaneiden solujen ympärille muodostuu plakkeja.

Virusinfektioiden diagnoosiin ja virusten antigeenisen rakenteen tutkimukseen käytetään geelin saostusreaktiota. Useimmiten käytetään agaria tähän tarkoitukseen. Agar-geeliin sijoitetut antigeenit ja spesifiset vasta-aineet tietyllä etäisyydellä hajoavat ja muodostavat sakka valkoisten kaistojen muodossa. 0,8-1% agaria isotonisessa natriumkloridiliuoksessa tai fosfaattipuskurissa sijoitetaan kapillaareihin tai kerrostetaan diaseihin. Antigeenit puhdistetaan ja väkevöidään edullisesti. Reaktion ainesosat levitetään agarille kapillaarin vastakkaisiin päihin tai lasikuidun agarkerrokseen tehtyihin kuoppiin 5-6 mm etäisyydellä. Inkubaatio kestää 4-20 tuntia.

Merkittävä määrä V. ja. suoritetaan valo- ja elektronimikroskopialla. Suurimmat virukset (esim. Isorokko) sopivan käsittelyn jälkeen (hopeointi, Victoria-väritys jne.) Voidaan havaita tavanomaisella valomikroskopialla. Tätä menetelmää käytetään isorokko-diagnoosiin tutkimalla materiaalia pustoleista. Joillekin infektioille tyypillistä on solujen sisältämien telosinkarkaisujen muodostuminen. Joten, ytimissä on sulfaatioita herpesi- ja adenovirusinfektioihin sytoplasmassa - isorokko (corpuscle Guarnieri) ja raivotautia (Babesh-Negri-keho). Sulkeutumisen havaitseminen on tärkeää raivotautien, isorokko, sytomegalia, subakuutti skleroottinen panencefaliitti ja muut diagnoosit.

Mikroskopia pimeässä kentässä (ks. Darkfield-mikroskooppi) ja vaihekontrastimikroskopia (ks. sov. tutkia viruksen tartunnan saaneiden solujen muutosten dynamiikkaa. Laajemmin käytetty luminesenssimikroskopia (katso).

Laskeilla kasvatettujen pinnan, tulosteiden ja yksikerroksisten soluviljelmien tutkiminen. Valmisteet (natiivi tai kiinteä) värjätään usein akridiini-oranssilla. Menetelmä mahdollistaa suurien virusten ja viruskomponenttien havaitsemisen. Muodot, jotka sisältävät DNA: ta hehkuvat kirkkaan vihreällä valolla ja RNA: ta sisältävät, ovat tiilipunainen. Vielä enemmän, kun V. ja. tuottaa infektoituneiden solujen hoitoa fluoresoivilla vasta-aineilla, mikä mahdollistaa viruksen antigeenien klusterien havaitsemisen. Suorassa menetelmässä käytetään immuuni gamma-globuliinia, joka on leimattu fluoresoivalla väriaineella, esimerkiksi fluoreskeini-isotiosyanaatilla. Välillisellä menetelmällä valmistetta käsitellään eläimen tavallisella immuuniseerumilla ja sen jälkeen leimalla olevilla vasta-aineilla tämän eläimen gamma-globuliinia vastaan. Valmisteita tutkitaan ultraviolettivalolla, viruksen antigeeni havaitaan vaaleanvihreä luminesenssi (katso Immunofluorescence). Ruuansulatuskanavan nesteiden menetelmä mahdollistaa hengitysvirusinfektioiden varhaisen diagnosoinnin - influenssan, parainfluenssan, rinon- ja adenoviruksen, hengitysteiden syncysiologian.

Elektronimikroskopia (katso) mahdollistaa viruspartikkeleiden koon ja rakenteen tutkimisen sekä niiden aiheuttamat hienot muutokset soluissa. Virustussuspensiota tai erittäin ohut osia infektoiduista soluista tutkitaan. Jotkut virukset (esim. Useat ihmisen ja eläimen onkumavirusvirukset) voidaan havaita kudoksissa vain tällä menetelmällä.

B. ja B., joiden tarkoitus - viruksen tai virusvasta-aineiden määrän (titterin) määrittäminen ovat hyvin erilaisia.

Elektronimikroskoopin alla on mahdollista laskea viruspartikkeleiden määrä suspensiossa, jos se on riittävästi puhdistettu. Virus sekoitetaan polystyreeni-lateksin kanssa, tunnettujen hiukkasten lukumäärä. Seos ruiskutetaan ruudukkoon, yksittäisten tippojen hiukkasten määrä lasketaan. Lateksipartikkelien ja virusten määrän suhde paljastaa virion määrän tietyssä tilavuudessa. Tämä menetelmä ei anna käsitystä viruksen tarttuvasta toiminnasta, koska viruslieteessä on tavallisesti merkittävä määrä ei-tarttuvaa hiukkasia.

Tarkka tapa määritellä tarttuvien yksiköiden määrä materiaalissa sallii plakkien menetelmän. Yksikerroksiset soluviljelmät infektoidaan pienellä virusannoksella. Tiitteri ilmaistaan ​​plakinmuodostusyksiköiden (PFU) määrällä 1 ml: ssa. Samoin voidaan määrittää virustiitteri joitakin onkogeeniseen transformaatioon koteihin, sekä ne aineet, jotka muodostavat pockmarks korioallantoiskalvoon kanan alkioiden (esim., Variola-virus).

Vähemmän tarkka on virustiitterin määrittäminen terminaaliliuosten menetelmällä. Yhdenmukaisesti kasvavia laimennoksia (yleensä kymmenkertaisia) annetaan herkälle eläimelle kana-alkioiksi tai soluviljelmiksi. Kun otetaan huomioon kunkin injektion tulos positiivisena tai negatiivisena, määritetään pienin virusannos, joka voi aiheuttaa tietyn vaikutuksen (eläimen sairauden tai kuoleman, sytopaattisten muutosten esiintymisen viljelmässä jne.). Käytännöllisesti katsoen tätä annosta on vaikea määrittää, joten lasketaan annos, joka antaa 50%: n vaikutuksen (ED50). Se määritetään riippuen viruksen ominaisuuksista ja titrausmenetelmistä kuolleiden eläinten lukumäärälle (LD50), tapausten määrä (ID50), niiden alkioiden lukumäärä, jotka kehittivät viruksen hemagglutiniineja tai komplementtia sitovia antigeenejä soluviljelmien lukumäärän mukaan, joissa sytopaattiset muutokset tai hemadsorptiivinen aktiivisuus havaittiin. Tiitteri ilmaistaan ​​ED50-numerolla tietyssä määrin materiaalia.

ED50: n laskentamenetelmistä käytetään yleisimmin Reed-Munch-menetelmää, joka perustuu kumulaation periaatteeseen. Se perustuu olettamukseen, että jokainen testiolio (hiiri, alkio), joka reagoi positiivisesti tämän laimennoksen käyttöönottoon, vastaisi positiivisella reaktiolla väkevämmin viruksen käyttöönottoon. Ja päinvastoin, jos tämä laimennus aiheutti negatiivisen reaktion, niin suuremmalla laimennuksella saadaan aikaan negatiivinen reaktio. Tämän menetelmän mukaisten laimennusten välisen välein tulisi olla sama, kukin kasvatus tarttuu vähintään 4 eläimeen (viljelmät). Lisää interpolointia annosten välillä, mikä aiheutti vaikutuksen, joka on lähinnä 50%. Laskenta tehdään kaavalla:

jossa B - pienin annos, joka aiheutti vaikutus enemmän kuin 50%, b - vaikutus annoksen prosentteina, ja - suurin annos aiheuttamaa vaikutus on pienempi kuin 50%, ja prosenttiosuus, d - väli logaritmit kahden vierekkäisen annosta.

Virukset, joilla on voimakas sytopaattinen aktiivisuus (esim. Polio-virus), voidaan titrata värinkokeiden avulla. Se perustuu siihen, että solujen kasvun aikana alustan pH laskee ja infektoituneissa viljelmissä, joissa solut degeneroituvat, väliaineen pH-arvo ei muutu. Näiden muutosten havaitsemiseksi lisätään fenolipunaista indikaattoria, jonka pH on yli 7 punaista, pH 7: n oranssilla ja pH alle 7 keltaisella. Fenolipuna lisätään ravintoalustaan, jonka pH on 7,3 - 7,4 lopullisessa konsentraatiossa 1: 40 000. Määritä solujen vähimmäisannos, joka muuttaa väliaineen väriä punaisesta keltaiseen (yleensä noin 25 000 - 0,25 ml). Seuraavaksi valmistetaan 10-kertaiset viruksen laimennokset, joista kukin kaadetaan 4-6 koeputkeen, johon solususpensio lisätään. Putket suljetaan kumitulpilla tai 0,6 - 0,8 ml vaseliiniliuosta kaadetaan. Tulokset otetaan huomioon 5-7 päivän ikääntymisen jälkeen t ° 37 °: ssa. Virustititterille otetaan sen laimennus, mikä estää pH: n siirtymisen happopuolelle 50% putkista.

Immuuniseerumien kyky neutraloida virusten tarttuvaa aktiivisuutta määritetään neutralointireaktiolla. Seerumien titrausmenetelmät määritetään ennalta määrätyillä virusten titrausmenetelmillä. Ne perustuvat viruksen seosten valmistukseen seerumin kanssa, minkä jälkeen ne testataan sellaisen viruksen poistamisen jälkeen, jota ei ole neutraloitu. Reaktio asetetaan kahteen versioon. Yhdessä näistä immuuni- ja normaali seerumin laimennoksena (esim., 1: 10) sekoitettiin yhä 10-kertaista laimennosta viruksen yhtä suureen tilavuuteen ja määrittää virustiitteri läsnä ollessa joko seerumia. ED: n osamäärä50 viruksen ollessa normaalin seerumin läsnä ollessa sen ED50: llä immuunin läsnä ollessa, on immuuniseerumin tämän laimennoksen neutralisaatio-indeksi. Tätä tulosta ei voida interpoloida muihin seerumin laimennuksiin (esim. Laimentamattoman seerumin aktiivisuus on suurempi kuin laskettu). Vaihtoehtoisesti viruksen vakioannos (tavallisesti noin 100 ED50) yhdistetään sarjaan 2-kertaisia ​​laimennoksia testiseerumissa. Seerumin tiitteri laimennetaan, kun to-ry-virus aiheutti 50%: n vaikutuksen.

Riippuen virus neutralointititrausmenetelmä reaktio suoritetaan koe-eläimillä kanan alkioiden (niiden hemagglutiniinit menetys tai kertymistä), soluviljelmissä (ulkonäkö sytopaattisen väri muuttuu näytettä ja r. N.). Jos virus muodostaa poikasia merkkejä kanan alkioiden chorioallantoic membraanista, määritetään suurin seerumin laimennus, mikä vähentää potilaiden lukumäärää 50 prosentilla tai enemmän. Samoin seerumit titrataan viruspilkkujen määrän vähenemisen mukaan yksikerroksisissa soluviljelmissä.

Virustitraatioon RGA ja HAI vasta perustuu kykyyn useiden virusten (miksovirusy, jotkut edustajat rokkovirusten, adenovirukset, picornaviruses ja Togaviridae) punasolujen pysyä yhdessä. Virus titrataan kahdessa laimennoksessa yhtä suurella tilavuudella 0,5-1% erytrosyyttisuspensiosta. Tiitterin (AE 1 - agglutinoivia yksikkö) ottaa sen suurin laimennos, joka aiheutti hemagglutinaation (cm.). Hemagglutinoivaa virustiitteri on mitta sen tarttuvan aktiivisuus hemagglutinaatio) voi aiheuttaa ei-tarttuvien "epätäydellinen" hiukkasia, inaktivoitu virus ja erotettavissa tiettyjen virustautien haemagglutinating antigeenin. Seraa RTGA: ssa titrataan kaksoislaimennuksissa 2-4 AE -viruksella; titteriä pidetään suurimpana laimennuksena, joka kokonaan estää hemagglutinaatiota).

Jotkut virukset adsorboituvat erytrosyytteihin, mutta eivät aiheuta niiden agglutinaatiota. Näiden havaitsemiseksi voit käyttää epäsuoraa hemagglutinaatioreaktiota. Se perustuu virtsatutkimuksen "erytrosyytti-kuormitetun" viruksen seerumin agglutinaatioon tämän viruksen suhteen. Tätä menetelmää käytetään pääasiassa seerumin titrauksessa.

Komplementin kiinnitysreaktio (katso) sopii sekä virusten (täsmällisemmin komplementin sitovien viruksen antigeenien) että vasta-aineiden titraukseen. Periaatteessa RSK: n virusten kanssa ei eroa bakteeri- ja muiden antigeenien kanssa. Eroja esiintyy vain antigeenien valmistusmenetelmässä. Viraalisia antigeenejä voi olla verta, nenänielun pesut, virtsan, ulosteen saaneiden potilaiden lietteen elinten osia tartunnan kanan alkioiden ja kasvatettiin soluviljelmissä viruksen. Sopivimmat ovat viljelyantigeenit. Suspensiot tartunnan elimet ennen käyttöä toistuvasti jäädytettiin ja sulatettiin, yhdistettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa eetteriä tai kloroformia, vorteksoitiin 1-2 tuntia, sitten sen annettiin seistä 18-20 tuntia. t ° 4 °: ssa jälleen jäätyä, sulata ja kirkastaa sentrifugoimalla. Seerumien saamiseksi eläimiä ei tule immunisoida viruksella, jota viljellään samassa substraatissa kuin reaktion antigeeni. Titrauksen tarkoituksesta riippuen antigeenin kaksoislaimennukset tietyllä seerumin annoksella tai päinvastoin seerumin kaksinkertaiset laimennokset yhdellä antigeeniannoksella yhdistetään. Antigeenin, seerumin ja komplementin kosketus suoritetaan 1 tunti t ° 37 ° tai 18 h. t ° 4-6 °. Hemojärjestelmän lisäämisen jälkeen materiaalia inkuboidaan 30 minuutin ajan. t ° 37 °. Tuloksia arvioidaan yleisten sääntöjen mukaisesti.

On olemassa menetelmiä titraamaan viruksia ja vasta-aineita, jotka perustuvat viruksen osoittamiseen infektoiduissa viljelmäsoluissa fluoresoivilla vasta-aineilla, samoin kuin lukuisia muita, joita käytetään harvoin.

Tiettyihin viruksiin liittyvä myrkyllinen vaikutus havaitaan antamalla suuria annoksia eläimille epätavallisella tavalla, jossa virus ei läpäise täydellistä sykliä. Esimerkiksi influenssavirus annetaan hiirille aivoissa tai suonensisäisesti. Sen myrkyllisestä vaikutuksesta arvioidaan eläinten kuolema ensimmäisenä päivänä.

Viruksen (tai rokotteen) antigeeninen aktiivisuus määritetään immunisoimalla ihmisiä tai eläimiä ja sitten määrittämällä vasta-ainetitterit niiden seerumissa. Rokotteen immunogeeninen aktiivisuus, toisin sanoen kyky saada aikaan vastustuskyky infektiolle, määritetään immunisoimalla eläimet, jotka ovat alttiita virukselle. Sitten immunisoidut eläimet ja kontrolliin, jotka eivät ole immunisoita, infektoidaan useilla viruksen laimennuksilla, määrittämällä sen ED50 molemmille ryhmille. Ero saatuihin indekseihin merkitsee testattavan lääkkeen immunogeenisyyttä. Jos viruksella ei ole patogeenisyyttä eläimille, vastaavan rokotteen immunogeenisyys voidaan määrittää vain epidemiolissa. kokemus.

Useiden viruksen ominaisuuksien (koko, rakenne, kemiallinen koostumus jne.) Tutkiminen edellyttää puhdistettua materiaalia, jolla on suuri titteri. Yleisimmin käytetty virus kasvatetaan soluviljelmissä tai tarttuvien kanojen alkioiden allantoottisen nesteen muodossa. Puhdistus alkavat yleensä differentiaalisentrifugointia ensin 15-20000 g (g- painovoiman kiihtyvyys) vapauttavaa materiaalia solujätteistä, ja 50-100000 g - saostetaan itse viruksen... Suurten hiukkasten vapautumista varten suodatusta käytetään myös asbestitiivisteiden (Zeitz-tyyppisten), lasin ja selluloosamembraanisuodattimien (kuten millipore) avulla. Virusten pienemmät fragmentit voidaan poistaa suodattamalla materiaali sefadex-geelien kautta, jotka huokoisen koon mukaan pitävät tietyn kokoisen partikkelin. Suurten tilavuuksien virittämistä ja konsentrointia varten, suolaamalla ammonium- ja natriumsulfaatteja, käytetään saostumista alkoholilla, alumiinihydroksidilla tai polyetyleeniglykolilla. Niiden vapauttamiseksi painolastiproteiineista käytetään myös niiden proteolyyttisten entsyymien digestioa. Miksovirukset voidaan puhdistaa ja konsentroida adsorptiolla erytrosyytteillä alhaisessa lämpötilassa, eluoimalla korkeammassa lämpötilassa.

Viruksen jatkuva puhdistus ja konsentraatio tuotetaan tällä tai sillä fraktiointimenetelmällä. Näitä menetelmiä käytetään myös erottamaan mutanttivirukset ja yksittäiset viruksen komponentit. Kun sekoitetaan viruksen kanssa faasin muodostama vesiliuokset kahden polymeerin, se menee yksi vaiheista riippuen niiden koosta, ionikoostumuksen väliaineen, pH, jne. Puhdistukseen suuri virukset käyttävät tyypillisesti dekstraani järjestelmä -. Metyyliselluloosa, pieni - dekstraanisulfaatti polyetyleeniglykolin kanssa. Polymeerit, jotka pysyvät faasien erottamisen jälkeen, poistetaan usein viruksen lisäpuhdistuksessa. Dekstraanisulfaatti voidaan myös poistaa lisäämällä kaliumkloridia, metyyliselluloosaa ammoniumsulfaatilla, polyetyleeniglykolilla kloroformilla ja muilla menetelmillä.

Virus Puhdistus pylväskromatografialla, joka perustuu niiden kykyyn adsorboida useita aineita, ja eluoitiin (ks. Kromatografia) kanssa muuttamalla pH: ta tai suolakonsentraatio. Adsorptio käyttää kalsiumfosfaattigeelejä, selluloosapohjaisia ​​ioninvaihtimia (useimmiten anioninvaihtimia, esim. Dietyyliaminoetyyliselluloosaa), ioninvaihtohartseja. Viruksen eluutio kalsiumfosfaatilla suoritetaan kasvavan pitoisuuden fosfaattipuskuriliuoksilla ja ioninvaihtimilla natriumkloridin selluloosapohjaisilla liuoksilla.

Korkeasti puhdistetut suspensiot saadaan sentrifugoimalla neste- kolonnissa, jonka tiheys jakautuu jatkuvaan gradienttiin. Viruspartikkelit kerätään tasolle, jossa väliaineen tiheys on yhtä suuri kuin niiden voimakas tiheys. Sakkonsentrifugointi sakkaroosigradientissa mahdollistaa hiukkasten erottelun eri massojen kanssa. Materiaali viedään gradienttiin, joka syntyy kerrosttamalla vastaavia sakkaroosiliuoksia. Sentrifugoinnin lopussa kerätään talteenottoja, jotka läpäisevät putken pohjan. Tasapainossa tai isopyklisessä sentrifugoinnissa viruspartikkelit suspendoidaan cesiumkloridin, cesium- sulfaatin tai rubidiumkloridin liuokseen. Pitkän sentrifugoinnin jälkeen syntyy vakaa jatkuva tiheysgradientti liuoksesta. Viruksen osissa hiukkaset voivat määrittää niiden tiheyden. On huomattava, että saadut tiheyden ja massaspektrometrien määrät tietyssä määrin riippuvat sentrifugoinnissa käytetystä väliaineesta.

Kun V ja. Useilla radioaktiivisilla isotooppeilla varustettuja viruksia käytetään laajalti. Yleisimmin käytetty hiili 14 C, tritium 3 H, fosfori 32 P, rikki 35 S, jodi 131 I. On helpointa leimata virus, kun sitä viljellään soluviljelmissä. Radioaktiivisuus määritetään nestetuikelaskureilla tai autoradiografialla (katso).

Chem. virusten koostumusta tutkitaan tavanomaisella kemilla. menetelmiä. Nukleiinihappoa saadaan tavallisesti fenoliuuttamalla ja anionisia detergenttejä, dodekyyliä tai natriumlauryylisulfaattia käytetään harvemmin.

Virusten tunnistamiseksi (katso) on ensin määritettävä geneerinen lisävaruste. Tätä varten on määritettävä viruspartikkeleiden koko ja rakenne, niiden nukleiinihapotyyppi, lipoidipäällysteen läsnäolo. Nukleiinihapon tyyppi määritetään useimmiten epäsuorilla menetelmillä, esimerkiksi käyttäen bromodeoksiuridiinin kykyä inhiboida DNA: ta sisältävien virusten lisääntymistä. Lipoidikerroksen läsnäolo viruksessa todetaan sen herkkyydellä eetterin ja kloroformin vaikutuksesta (verhottu virukset inaktivoituvat). Lisäksi tunnistus suoritetaan joukko antiseerumien tunnettujen virusten käyttäen erilaisia ​​reaktioita -. Neutraloidaan, DGC, HI, jne. Vähemmän immunisoiduissa eläimissä tuottaa tunnetun viruksen kanssa edelleen tuntematon saastumisen tai päinvastoin.

Tuotantoa: Viruksen ja rickettsiaalisten sairauksien laboratoriodiagnostiikka, toim. E. Lennet ja N. Schmidt, toim. englanniksi., M., 1974, bibliograf.; Luria G. Ye., Ja Darynl JE, Yleinen virologia, trans. englanniksi., M., 1970, bibliograf.; Virologian ja molekyylibiologian menetelmät, trans. englanniksi., M., 1972; VA Shchennikov-Sh., Semenov BF иЗезе-р о в Е. Г. / Virologisen tutkimuksen menetelmät, M., 1974, bibliograf.; Käsikirja virus- ja rytmihäiriötautien laboratorioanalyysiin, toim. PF Zdrodovsky ja MI Sokolov, M., 1965; Sokolov MI, Sinitskii AA ja Remezov PI Virologiset ja serologiset tutkimukset virusinfektioissa, L., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Menetelmät virusten tutkimiseksi

Erilaiset virustutkimuksen menetelmät. Elektronisen ja immunoelektronisen mikroskopian ydin, merkitys ja soveltaminen, immunofluoresenssimenetelmän spesifisyys. Molekyylihybridisaation menetelmän kuvaus. Elektronimikroskoopin järjestelmä.

Hyvän työn lähettäminen tietopohjaan on helppoa. Käytä alla olevaa lomaketta

Opiskelijat, jatko-opiskelijat, nuoret tiedemiehet, jotka käyttävät tietämyspohjaa opinnoissa ja työssä, ovat hyvin kiitollisia sinulle.

Hosted on http://www.allbest.ru/

Venäjän federaation opetus- ja tiedeministeriö

Liittovaltion valtiontalouden korkeakouluopetuksen oppilaitos

Luonnontieteellinen tiedekunta

Kasvatustieteen ja genetiikan osasto

Menetelmät virusten tutkimiseksi

Valmistunut: Evteeva D.S.

VIRUSTEN TUTKIMUSMENETELMÄT

VIRUKSEN ELEKTRONINEN MIKROSCOPIO

MOLEKULAARIN HYBRIDISAATION MENETELMÄ

LUETTELO KÄYTETTÄVÄN KIRJALLISUUDESTA

Virukset, jotka velvoittavat solunsisäisiä loisia, eivät voi kasvaa keinotekoisilla ravintoaineilla. Ne voivat toistaa vain herkkien isäntien eli elävien solujen, jotka ovat herkkiä virukselle.

Vastaanottavaa isäntäorganismia virusten tutkimiseen käytetään niissä tapauksissa, joissa ei ole kokeellisia järjestelmiä virusinfektioiden patogeneesin tutkimiseen, kun tutkitaan virusten rokotteiden turvallisuutta tai virusviruksen erityisiä vaarattomuutta huumeita. Ilmeisten etujen ohella menetelmiin liittyy haittoja ja rajoituksia, jotka liittyvät tulosten standardoinnin ja toistettavuuden vaikeuksiin, sekä kokeiden suhteellisen korkeiden kustannusten vuoksi.

Soluviljelmät, jotka otettiin tutkimustyöhön 1940-luvulla, muuttivat radikaalisti virologian metodologista arsenaalia.

Tällä hetkellä kulttuuriset menetelmät ovat perustavia kokeellisessa ja käytännöllisessä virologiassa.

Virologiassa käytettävät tutkimusmenetelmät eroavat merkittävästi monimutkaisuudesta, mikä johtuu pääasiassa virusten absoluuttisesta solunsisäisestä parasiikasta ja niiden pienestä koosta.

VIRUSTEN TUTKIMUSMENETELMÄT

Virologiassa käytettävät tutkimusmenetelmät eroavat merkittävästi monimutkaisuudesta, mikä johtuu pääasiassa virusten absoluuttisesta solunsisäisestä parasiikasta ja niiden pienestä koosta.

Virusta infektoituneilta potilailta saatujen materiaalien tutkimuksessa käytetään erilaisia ​​menetelmiä näiden tautien laboratoriodiagnoosiin:

· Elektroni- ja immunoelektronimikroskopian menetelmät;

· Menetelmä molekyylihybridisaatiolle;

· Immunfluoresenssimenetelmä;

· Luokan lgM vasta-aineiden tunnistaminen.

ELEKTRONINEN MIKROSCOPIA

Elektronimikroskopia on menetelmä, jolla tutkitaan rakenteita, jotka eivät ole valomikroskoopin näkyvyyden rajoissa ja joiden mitat ovat pienempiä kuin yksi mikronia (1 mikronista 1-5 A: ksi).
Toiminta elektronimikroskoopilla (Pril.1.ris.1) perustuu käyttöön suuntaava elektroni vuon, joka toimii valonsäteen valon mikroskoopilla, ja roolin linssit magneetit (magneettinen linssi).

Koska tutkittavan kohteen eri osat säilyttävät elektronit eri tavoin, elektronimikroskoopin näytöllä saadaan tutkittavan kohteen mustavalko kuva, joka suurenee kymmeniä ja satoja tuhansia kertoja. Biologiassa ja lääketieteessä käytetään pääasiassa läpikuultavia tyyppiä olevia elektronimikroskoppeja.

Elektronimikroskopia syntyi 1930-luvulla, jolloin saatiin ensimmäisiä kuvia joistakin viruksista (tupakan mosaiikkivirus ja bakteriofagit). Tällä hetkellä elektronimikroskopia on löytänyt laajan hakemuksen sytologiassa, mikrobiologiassa ja virologiassa, mikä aiheuttaa uusien tieteenalojen luomista. Biologisten esineiden elektronisella mikroskoopilla käytetään erityisiä valmistusmenetelmiä. Tämä on välttämätöntä tutkittavien esineiden (virus) yksittäisten komponenttien tunnistamiseksi sekä niiden rakenteiden säilyttämiseksi korkeissa tyhjiöolosuhteissa elektronisuihkun alla.

Elektronimikroskopian avulla tutkitaan esineen ulkoista muotoa, sen pinnan molekyyliorganisaatiota, käyttäen ultra-ohutlajin menetelmää, tutkitaan kohteen sisäistä rakennetta.

Elektronimikroskoopilla yhdistettynä biokemiallisia, sytokemiallisten tutkimusmenetelmät, immunofluoresenssilla, ja X-ray analyysi antaa oivalluksia koostumus ja tehtävät rakenteellisten elementtien solujen ja virusten.

Negatiivisen kontrastin menetelmällä värjätyt virusten elektronimikroskopiot mahdollistavat virusten erilaistumisen ja niiden pitoisuuden määrittämisen. Elektronimikroskopian käyttö virusinfektioiden diagnoosiin rajoittuu tapauksiin, joissa viruspartikkeleiden pitoisuus kliinisessä materiaalissa on riittävän suuri (105 in 1 ml tai enemmän).

Menetelmän haittapuolena on kyvyttömyys erottaa samaan taksonomisiin ryhmään kuuluvia viruksia. Tämä puute on eliminoitu käyttämällä immuunielektronimikroskopiaa.

Menetelmä perustuu immuunikompleksien muodostumiseen, kun spesifistä seerumia lisätään viruspartikkeleihin, kun taas viruspartikkeleiden samanaikainen konsentraatio mahdollistaa niiden tunnistamisen. Menetelmää käytetään myös vasta-aineiden havaitsemiseen. Ekspressiagnostiikassa suoritetaan elektronimikroskooppinen tutkimus kudosten, ulosteiden, nesteestä vesikkeleistä, nenänielun salaisuuksista.

Elektronimikroskopiaa käytetään laajalti viruksen morfogeneesin tutkimiseen, sen mahdollisuuksia laajennetaan käyttämällä merkittyjä vasta-aineita.

IMMUNEELECTRONIC MICROSCOPY

Se on suora visuaalinen visualisointi antigeenin ja vasta-aineiden vuorovaikutuksesta elektronimikroskopialla, jota alun perin ehdotettiin J. Almeidan ja A. Watersonin virologisissa tutkimuksissa vuonna 1969.

Menetelmällisesti IEM-testi suoritetaan seuraavassa järjestyksessä:

1. Materiaali, jossa haluttua virusta epäillään, sekoitetaan ja inkuboidaan standardin immuuniseerumilla;

2. Virus-vasta-ainekompleksi saostetaan sentrifugoimalla sopivissa hoito-ohjelmissa;

3. Suspendoituun sedimenttiin lisätään kontrastiainetta ja tuloksena olevaa valmistetta tutkitaan elektronimikroskoopilla.

Positiivisen reaktion tapauksessa paljastuu ominaisia ​​aggregaatteja, jotka koostuvat vasta-aineiden siltojen yhdistämistä viruspartikkeleista. IEM: n herkkyysraja on alhainen: viruksen luotettava havaitseminen on mahdollista, kun sen pitoisuus lähtöaineessa on 10 ^ 4-10 6 partikkelia / ml.

Menetelmän etuna on kyky arvioida paitsi serologisen reaktion lopputulos, myös tunnistaa sen morfologinen substraatti eli viruspartikkeleiden muodon ja koon määrittäminen. Viruksen tunnistetulla hiukkaspitoisuudella varustettujen valmisteiden läsnä ollessa IEM voidaan käyttää vasta-aineiden kvantitatiiviseen määrittämiseen seerumeissa, joille on ehdotettu erityinen järjestelmä viruksen ja vasta-aineiden vuorovaikutuksen voimakkuuden rekisteröimiseksi.

Serologinen Methods in Virology, joka perustuu klassiseen immunologiset reaktiot Reaktiot komplementinsitoutumismäärityksillä, hemagglutinaation inhibitio, biologinen neutralointi, immunodiffuusio, epäsuora hemagglutinaatio, radiaalinen hemolyysi, immunofluoresenssilla, entsyymi-immunomäärityksellä, radioimmunomääritys. Monien reaktioiden mikrometodeja on kehitetty, niiden tekniikkaa parannetaan jatkuvasti.

Näitä menetelmiä käytetään tunnistamaan viruksia käyttäen tunnettuja seerumijoukossa serodiagnosoinnissa ja kasvun määrittämiseksi ja vasta-aineen toisen seerumissa verrattuna ensimmäiseen (ensimmäinen otetussa seerumissa sen jälkeen, kun ensimmäisten päivien taudin, toinen - jälkeen 2-3 viikkoa.). Diagnostinen arvo on vähintään nelinkertainen lisäys vasta-aineissa toisessa seerumissa. Jos IgG-vasta-aineiden havaitseminen viittaa äskettäiseen infektioon, niin IgG-vasta-aineet kestävät useita vuosia ja joskus myös elinaikaa. Yksittäisten virusten ja vasta-aineiden tunnistamiseksi monimutkaisissa seoksissa ilman proteiinien alustavaa puhdistusta käytetään immunoblottausta.

Menetelmä yhdistää proteiinien fraktioinnin elektroforeesilla polyakryyliamidigeelissä, mitä seuraa proteiinien immunoanalyysi entsyymi-immunomäärityksellä. Proteiinien erottaminen vähentää antigeenin kemialliselle puhtaudelle asetettuja vaatimuksia ja mahdollistaa antigeenivasta-aineen yksittäisten parien tunnistamisen. Tämä ongelma on tärkeä, kuten serodiagnoosiin HIV, jossa väärät positiiviset reaktiot immuunomäärityksen johtuen vasta-aineiden läsnäolon Soluantigeenien, jotka ovat läsnä seurauksena riittämätön siivous virusproteiinien.

Vasta-aineiden tunnistaminen potilaiden seerumeissa sisäisille ja ulkoisille viruksen antigeeneille mahdollistaa taudin vaiheen määrittämisen ja populaatioiden analysoimisen - virusproteiinien vaihtelun.

Immunoblottausta HIV-infektiossa käytetään vahvistavana testinä yksittäisten virusantigeenien ja vasta-aineiden havaitsemiseksi. Populaatioiden analyysissä menetelmää käytetään virusproteiinien vaihtelun määrittämiseen.

Menetelmän suuri arvo on mahdollisuus analysoida rekombinantti-DNA-tekniikalla syntetisoituja antigeenejä, määrittämällä niiden koko ja antigeenisten determinanttien läsnäolo.

viruksen molekyylihybridisaatiomikroskooppi

Immunfluoresenssimenetelmää tai immunofluoresenssireaktiota (RIF) käytetään mikrobiologisissa laboratorioissa, jotka on varustettu fluoresoivalla mikroskoopilla.

Tutkimuksessa käytetään suoria ja epäsuoria immunofluoresenssireaktioita.

Kun immunofluoresenssin suoraa reaktiota käytetään diagnostiikkaan, etanolille kiinnitetyt kliiniset aineet levitetään liuokseen.

Sitten siihen lisätään luminoivaa seerumia. Tee huumeiden tutkiminen luminoivalla mikroskoopilla.

Antigeenivasta-aineen immunologinen reaktio tapahtuu suoraan diassa. Esimerkiksi influenssa-antigeeni, joka on liittynyt leimatun immunoglobuliinin, mikroskoopilla on muodoltaan kirkas hehkuva jaettujen partikkeleiden ydin ja sytoplasmassa infektoituneissa soluissa. Menetelmä on yksinkertainen, mutta se vaatii luminesoivia seerumeita jokaiselle antigeenityypille.

Immunogluoresenssin epäsuoran reaktion ydin on se, että liukuvasta ensin antigeeni sitoutuu spesifiseen (leimaamattomaan) seerumiin. Lumensoiva seerumi lisätään lasille muodostettuun antigeeni-vasta-ainekompleksiin.

Viimeinen vaihe on mikroskoppi, joka tunnistaa leimatut kompleksit.

Tämä menetelmä käyttää pieni määrä luminesoivia seerumeita, joten sitä käytetään laajalti bakteerien, röyhtäily-, pneumokokki-infektioiden havaitsemiseen.

Sen avulla on helppo tunnistaa influenssavirukset, parainfluenssa, adenovirukset, hengitysteiden syncysiovirus, sytomegalovirus. Legionellan ja klamydiainfektion diagnoosi olisi myös suoritettava immunofluoresenssireaktiolla sopivan antigeenin määrittämiseksi.

MOLEKULAARIN HYBRIDISAATION MENETELMÄ

Viruskohtaisten nukleiinihappojen havaitsemiseen perustuvan molekyylihybridisaation menetelmä mahdollistaa geenien yksittäiskappaleiden havaitsemisen ja se ei ole verrattavissa herkkyyden asteeseen.

Reaktio perustuu DNA: n tai RNA: n (koettimien) komplementaaristen säikeiden hybridisaatioon ja kaksoisjuosteisten rakenteiden muodostumiseen. Edullisin koetin on kloonattu rekombinantti-DNA. Koetin on merkitty radioaktiivisilla esiasteilla (tavallisesti radioaktiivisella fosforilla). Kolorimetristen reaktioiden mahdollinen käyttö.

Molemmilla hybridisaatiolla on useita muunnelmia: piste, blot-hybridisaatio, sandwich-hybridisaatio, in situ -hybridisaatio jne.

LUETTELO KÄYTETTÄVÄN KIRJALLISUUDESTA

1) virusinfektioiden laboratoriodiagnoosi, NN Nosik, V.M. Stakhanov

2) Virologian instituutti. D. ja. Ivanovo RAMS, Moskova ; laboratorio diagnoosi of virus- infektiot, N.N. Nosik, V.M. Stachanova

3) Atlas ihmisen ja eläimen virusten anatomiasta ja ontogeneesistä, AA Avakyan, AF Bykovskii, 1970

4) Viruksen planeetta, Carl Zimmer, 2012

5) http://www.serdechno.ru/enciklopediya/3171.html